人Ⅳ型胶原ELISA检测试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人Ⅳ型胶原（Col Ⅳ）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成黄色。颜色的深浅和样品中的人Ⅳ型胶原（Col Ⅳ）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。
本试剂盒组成如下：
实验前，要先进行洗涤，本试剂盒洗涤方法如下：
1.自动洗板机：每孔加入洗涤液350μl，注入与吸出间隔60秒。洗板5次。
2.手工洗板：甩尽孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干，每孔加洗涤液350μl，浸泡1-2分钟，吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体，在厚的吸水纸上拍干。洗板5次。
人Ⅳ型胶原ELISA检测试剂盒实验开始前，各试剂均应平衡至室温；试剂或样品配制时，均需充分混匀，并尽量避免起泡。
1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。给酶标板覆膜，37℃孵育2小时。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2.弃去液体，甩干，每个孔中加入工作液100μl(在使用前15分钟内配制)，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。
3.弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约350μl/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
4.每孔加工作液(临用前15分钟内配制)100μl，加上覆膜，37℃温育1小时。
5.弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3。
6.每孔加底物溶液100μl，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15分钟左右(根据实际显色的情况酌情缩短或延长，但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时，即可终止)。
7.每孔加终止液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。
8.立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。应提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。
9.实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存至有效期结束。
当然，要想实验结果更加可靠，这些事项也是要引起注意的：
1、浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
2、如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔一孔的OD值），请先将样本稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请后乘以稀释倍数（×5×n）。
3、各步加样均应使用加样器，并经常校对其正确性，以避免试验误差。一次加样时间好控制在5分钟内，如标本数目多，推荐使用排枪加样。
4、严格按照说明书的操纵进行，人Ⅳ型胶原ELISA检测试剂盒试验结果判定须以酶标仪读数为准。
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